Het bestuur van het weeshuis bestond uit zes rijke Amsterdamse heren, de regenten. Ze vergaderden wekelijks in de regentenkamer, die nog in oorspronkelijke staat in het museum te bezoeken is. Er waren ook vier regentessen, rijke burgerdames die apart van de heren vergaderden. Zij hielden onder andere toezicht op het personeel voor de jongste wezen en de oudere meisjes. Het bestuurswerk was onbetaald maar eervol.
